* 本文摘自：中国畜禽种业
* 作者：蔡曼珊，王晨燕，陈铭怡，侯 博，瞿 浩
滑液囊支原体（Mycoplasma synovia，MS）是感染鸡和火鸡的一种致病性病原体，目前已广泛存在于我国不同品种鸡群中。MS活疫苗免疫是一种有效的防控手段，评价MS疫苗在商品鸡群中的免疫效果，对于开展MS防控技术研究具有十分重要的意义，且可以为临床生产实践中MS感染防控积累经验。本研究尝试在黄羽肉种鸡中免疫MS-H株疫苗后，定期对鸡群血清抗体和上颚裂拭子中的MS-H疫苗菌株和野毒菌株进行监测，对MS-H株在鸡群中的定殖能力和定殖维持时间进行评估，科学评估MS-H疫苗使用后对于MS野毒菌株感染的预防效果，为有效防控MS提供新的技术支持，为临床科学防控鸡群MS的感染提供科学方法或理论依据，为后续开展滑液囊支原体病的综合防控技术研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要试验材料
MS-H株、TS-11株疫苗购自青岛伟德bv1946药业有限公司，其由澳大利亚生物资源公司生产；MS抗体检测试剂盒Mycoplasma Synoviae Antibody Test Kit购自BioChek公司；细菌DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；可鉴别疫苗株MS-H和野毒菌株的鸡滑液囊支原体双重荧光定量PCR检测试剂盒购自山东信达基因科技有限公司。
1.2 动物试验设计
选取一个黄羽肉种鸡父母代场，同一个品种共6个批次鸡群。每个批次在1～14日龄使用两轮支原体敏感抗生素进行药物预防，21日龄免疫TS-11和MS-H各1羽份、90日龄再免疫MS-H活疫苗1羽份，全程不免疫MS灭活疫苗，14日龄后不使用支原体敏感抗生素。从1日龄开始以大约2周的间隔定期跟踪采样，每批鸡每次随机采集24份血液样品和24份上颚裂拭子，其中每3份上颚裂拭子合并为1个混合样品，实行3合一检测。将采集的上颚裂拭子置于3mL的PBS缓冲液中，-20℃保存用于MS病原荧光定量PCR检测。
1.3 血清抗体的检测
将采集的血液37℃放置4h，2～8℃放置6h后，1000r/min离心10min后分离血清，-20℃保存用于MS抗体检测。采用BioChek公司MS抗体检测试剂盒，按照试剂盒说明书对血清中的MS抗体进行检测。
1.4 MS-H株和MS野毒菌株的荧光定量PCR检测
样品前处理参照中华人民共和国国家行业标准《禽支原体PCR检测方法》（NYT 553—2015）进行。采用山东信达基因科技有限公司鸡滑液囊支原体双重荧光定量PCR检测试剂盒，按照说明书进行MS-H疫苗株和野毒菌株的检测。
2 结果
2.1 MS抗体检测结果
由图1可知，所有鸡群的鸡在1日龄采样检测MS抗体均呈现阳性，平均滴度在3000～5000，随着日龄的增加母源抗体水平逐渐降低，在14、28、42日龄时MS抗体基本呈现阴性，且阳性率较低。在21日龄进行MS-H疫苗免疫后，所有鸡群在56日龄陆续出现MS抗体转阳。
图1 MS-H株疫苗免疫的6批次父母代黄羽肉种鸡MS抗体检测
在6批鸡群中有4批鸡群在56日龄前没有检测到野毒（图2），说明56日龄检测到的抗体主要来源于疫苗免疫，即活苗免疫后28d可以陆续产生抗体，逐渐出现MS抗体转阳，但此时的平均抗体滴度较低，一般在2000以下。鸡群20211112批在56日龄的MS抗体阳性程度较高，其平均滴度接近5000（图1），结合病原监测数据，该批鸡在42日龄发生了较严重的MS野毒感染。MS抗体转阳后滴度水平较少升高至5000，这与MS野毒感染的滴度抗体水平达到10000，甚至30000相比，疫苗免疫的MS抗体水平较低，且MS抗体水平起伏较小。在140日龄鸡群准备开产时，6批鸡抗体阳性率在56%～95%，此时抗体滴度处于养殖全期高峰，后续没有野毒持续刺激的情况下，在200日龄前后抗体滴度下降到2000左右（图1）。
2.2 MS病原的荧光定量PCR检测结果
6批次鸡群中，2批次在42日龄首次检出野毒菌株，阳性率分别为100%、37.5%。另外4批次群分别在70、70、84、112日龄检出野毒菌株，且阳性率均在25%以下（图2）。
MS-H疫苗菌株定殖和维持方面：6批鸡群在疫苗免疫后1周均检出了MS-H株，大部分鸡群在免疫后3～5周定殖率达到了最高，均超过了80%，部分鸡群的定殖率可达100%（图3）；维持方面，检测结果显示直到52周龄，MS-H株的检出率仍维持在62.5%～87.5%（图3），说明鸡群在90日龄前进行两次MS-H株活苗免疫，在鸡群中定殖率较高，且维持时间较长。通过对整个饲养周期野毒菌株和MS-H疫苗株的检测结果分析，发现饲养期间即使出现多批次野毒菌株反复感染的情况，但除了2批鸡在42日龄出现一次100%、37.5%野毒菌株感染外，其他的野毒菌株阳性率均未超过25%，未出现大范围的MS野毒感染（图2和图3），说明即便试验周期内存在早期MS野毒菌株的感染，但并未在鸡群中大范围的蔓延和扩散。
图2 MS-H株疫苗免疫的6批次父母代黄羽肉种鸡MS野毒感染检测
图3 MS-H株疫苗免疫的6批次父母代黄羽肉种鸡MS-H株疫苗定植检测
3 讨论
从2010年至今，滑液囊支原体感染给我国养鸡行业造成了严重的危害和损失，MS可以水平传播和垂直传播，一旦感染就会在鸡体内终生定殖。虽然各大养殖企业都采取了加强生物安全措施、支原体敏感抗生素使用、支原体灭活疫苗免疫等手段，但MS在中国仍然广泛流行。因此，目前的防控方法都无法阻止MS野毒在鸡群中的水平传播，尤其是在多日龄混养的鸡场，MS野毒在鸡场循环感染，造成鸡群生产性能受到严重影响。
本研究旨在评估MS-H株疫苗在黄羽肉种鸡父母代鸡群中的定殖效果和定殖时间，评价MS-H株预防和阻止MS野毒菌株感染的能力，给养殖企业提供一个有效控制MS野毒菌株感染的方案。有研究表明在SPF鸡当MS-H株免疫剂量等于或大于4.8×105CCU时，免疫后6周进行攻毒，免疫鸡的气囊损伤程度、气囊损伤发生率显著降低，MS攻毒毒株在气管和气囊的定殖率均显著下降[13]，且MS-H株诱导的保护性免疫在疫苗接种后至少可维持40周[14]。本研究通过在规模化养殖场连续对6批次鸡群免疫后，定期跟踪MS抗体水平以及对MS-H株疫苗菌株和MS野毒菌株的检测来看，通过滑液囊支原体活疫苗MS-H的2次免疫，疫苗株可以在鸡体内终生定殖，且MS野毒菌株的感染率较低。MS-H株活疫苗免疫可以降低MS野毒菌株攻毒的气管中的载量和在鸡群中的水平传播，可以使MS阳性的多日龄农场转为MS感染阴性[15]。本研究通过对6批次鸡群采用MS-H株疫苗两次免疫后，大部分鸡群在免疫后3～5周MS-H株定殖率达到了最高，均超过了80%，部分鸡群的定殖率可达100%，直到52周龄MS-H株的检出率仍维持在62.5%～87.5%，在野毒菌株检测方面发现除了2批鸡在42日龄出现一次100%、37.5%野毒菌株感染外，其他的野毒菌株阳性率均未超过25%，未出现大范围的MS野毒感染。有研究表明MS-H株的免疫可以成功的替换鸡群中的MS野毒菌株[15]，而MS灭活疫苗免疫却不能阻止MS的感染[16]，本研究中的6批次鸡群MS野毒菌株未发生严重感染可能与MS-H株免疫阻断MS野毒菌株的水平传播和替换鸡群中已感染的MS野毒菌株相关。因此从本研究中的6批鸡免疫后的抗体水平监测、疫苗菌株在鸡群的定殖和野毒在鸡群的感染情况监测，生产上可以通过定期监测疫苗定殖率、野毒率、以及抗体滴度、抗体离散度来判断鸡群免疫是否成功以及野毒感染情况。由于种鸡感染MS后，可造成蛋壳质量变差、孵化率下降以及引起垂直传播，因此在种鸡中的支原体疫苗免疫的最主要目的是避免中大鸡或产蛋鸡的MS野毒菌株感染。在本研究的20211112批的鸡群中，鸡群在42日龄已经监测到100%野毒感染，56日龄抗体滴度接近5000，即使鸡群已经进行了活疫苗免疫，且活疫苗定殖率最高时达到100%，仍然出现了早期严重的野毒感染和不同日龄野毒的多次检出。提示在生产上，除了做好疫苗免疫外，要抓好饲养管理，包括鸡群健康、生物安全、环境消毒等，采取综合措施以减少野毒菌株在鸡群的水平感染。本研究结果显示MS-H株疫苗的使用以及在鸡群的定殖可能会阻止MS野毒菌株的感染，控制MS感染在鸡群的水平扩散和传播，这将为控制和根除MS感染具有重要作用。
4 结论
商品化的MS-H株疫苗黄羽肉种鸡群中，进行2次免疫，可以成功的阻止MS野毒株在鸡群中的水平传播能力，降低MS野毒株的感染率。